本文來自微信公眾號(hào)： RNAScript ，作者：一一

在mRNA藥物的工業(yè)化生產(chǎn)里，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的包封率不但是關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），更是決定藥效與安全性的基礎(chǔ)?？?a href="http://www.tbpl000603.cn/news/zhikubaogao">行業(yè)用了多年的“金標(biāo)準(zhǔn)”，像RiboGreen熒光法，本質(zhì)上是“破壞性”檢測：得破乳后對(duì)mRNA定量，樣品就報(bào)廢了，還沒法捕捉mRNA在LNP內(nèi)部的原位狀態(tài)。

這種“拆盲盒”式的質(zhì)控，面對(duì)復(fù)雜的LNP配方優(yōu)化和實(shí)時(shí)生產(chǎn)監(jiān)控需求，越來越力不從心。

有沒有一種技術(shù)，能像給疫苗瓶拍“X光片”，不打開瓶蓋、不破壞樣品，就能立刻看清內(nèi)部mRNA是被完美包裹，還是“裸奔”？

奧爾巴尼大學(xué)的Igor Lednev教授團(tuán)隊(duì)，正把這個(gè)設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。繼2024年以封面文章展示深紫外共振拉曼光譜（DUVRR）在mRNA穩(wěn)定性檢測的潛力后，近期又在《Analytical Chemistry》發(fā)表重磅研究，成功將這項(xiàng)源于法醫(yī)鑒定的“光學(xué)指紋”技術(shù)，用于LNP包封率的無損定量分析。

從“犯罪現(xiàn)場”到“制劑車間”：跨界的降維打擊

Igor Lednev教授的履歷很傳奇。過去20多年，他主要用激光分析犯罪現(xiàn)場的血跡、毛發(fā)——從一滴干血跡里，能讀出遺留者的年齡、性別，甚至血跡暴露時(shí)間。

當(dāng)COVID-19讓mRNA技術(shù)走到臺(tái)前，Lednev敏銳地覺得，他手里的“法醫(yī)工具”或許能解決制藥界的燃眉之急。

“不管是血跡還是疫苗，本質(zhì)都是復(fù)雜的生物化學(xué)體系，”Lednev說，“拉曼光譜能告訴我們分子的獨(dú)特振動(dòng)指紋，這對(duì)分析mRNA在LNP里的狀態(tài)很重要?！?/p>

技術(shù)破局：DUVRR如何看穿“脂肪泡泡”？

檢測LNP內(nèi)部的mRNA，有兩大天然障礙：

• 信號(hào)淹沒：復(fù)雜脂質(zhì)環(huán)境中，mRNA信號(hào)弱，容易被脂質(zhì)背景覆蓋；

  
  

  
  

• 狀態(tài)模糊：現(xiàn)有方法難區(qū)分mRNA是被完美包裹，還是部分吸附在顆粒表面。

  
  

  
  

Lednev團(tuán)隊(duì)的破解方法，有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：

1. 深紫外“共振”效應(yīng)，讓mRNA信號(hào)“鶴立雞群”

   
   

   
   

   團(tuán)隊(duì)用的是自建的深紫外拉曼系統(tǒng)，激發(fā)波長設(shè)為266 nm。這波長正好在核酸堿基（嘌呤和嘧啶）的強(qiáng)吸收峰上。

   
   

   
   

1. 原理：當(dāng)激發(fā)光波長和分子的電子吸收帶重合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生共振拉曼效應(yīng)，讓特定基團(tuán)的信號(hào)增強(qiáng)百萬甚至千萬倍。

   
   

   
   

2. 效果：這次研究里，266 nm激光讓mRNA的拉曼信號(hào)“脫穎而出”，就算脂質(zhì)濃度很高，也能清晰捕捉mRNA的結(jié)構(gòu)信息，有效避開了脂質(zhì)的熒光干擾。

   
   

   
   

不只是有或無，更是“包裹得緊不緊”







如果說之前的工作（穩(wěn)定性檢測）是判斷mRNA“有沒有壞”，那這篇新作的核心是判斷mRNA“有沒有被包好”。研究團(tuán)隊(duì)巧妙設(shè)計(jì)了系列實(shí)驗(yàn)：固定mRNA濃度，逐步降低LNP的脂質(zhì)比例，人為模擬從“完全包封”到“完全游離”的連續(xù)狀態(tài)（圖1）。通過DUVRR光譜，他們捕捉到了和脂質(zhì) - mRNA相互作用相關(guān)的振動(dòng)模式變化。

圖1.脂質(zhì)含量遞減的mRNA - LNP制劑示意圖

圖2.緩沖溶液、緩沖液中的LNP以及用10μg mRNA與不同體積LNP混合制備的樣品的DUVRR光譜，對(duì)應(yīng)的mRNA與脂質(zhì)的質(zhì)量比（w/v）分別為：10%、30%、50%、60%、70%、80%和90%。緩沖液中不含脂質(zhì)的游離mRNA標(biāo)記為100%mRNA（A）。圖B繪制了mRNA與LNP的質(zhì)量比從50%到100%時(shí)，1334、1484、1560和1585 cm?1附近的DUVRR譜帶強(qiáng)度

機(jī)器學(xué)習(xí)賦能：從復(fù)雜光譜中提取“包封率指示劑”

人眼很難從幾十個(gè)重疊的拉曼峰里讀出精準(zhǔn)的包封率。Lednev團(tuán)隊(duì)的秘密武器是先進(jìn)的光譜數(shù)據(jù)分析工具。

• 主成分分析（PCA）：清楚地揭示出，1270 - 1800 cm?1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜變化和脂質(zhì)含量高度相關(guān)。這一區(qū)域正好對(duì)應(yīng)mRNA堿基的環(huán)振動(dòng)模式，說明當(dāng)mRNA和脂質(zhì)相互作用或被包裹時(shí)，其堿基的微環(huán)境改變了。

  
  

  
  

  

  
  

  圖3.前兩個(gè)主成分得分值隨mRNA比例變化的曲線圖

  
  

  
  

• 雙跡二維相關(guān)光譜（2T2D - COS）：這是該研究的方法學(xué)亮點(diǎn)。因?yàn)閙RNA和脂質(zhì)的信號(hào)在常規(guī)一維光譜中高度重疊，團(tuán)隊(duì)首次引入雙跡二維相關(guān)光譜（2T2D - COS）這一高級(jí)分析工具。通過對(duì)1270–1395 cm?1關(guān)鍵區(qū)域的深度解卷積，研究人員像有了“顯微鏡”，從雜亂背景中精準(zhǔn)鎖定了兩個(gè)決定性的振動(dòng)標(biāo)記：1329 cm?1（對(duì)應(yīng)游離mRNA）和1322 cm?1（對(duì)應(yīng)LNP結(jié)合態(tài)mRNA）。

  
  

  
  

  簡單說，1322 cm?1處的譜帶強(qiáng)度就像內(nèi)置的“分子傳感器”

  
  

  
  

• 高響應(yīng)（~0.035 a.u.）：說明mRNA被完美包封；

  
  

  
  

• 低響應(yīng)（~0.01 a.u.）：意味著mRNA處于“裸奔”狀態(tài)。

  
  

  
  

這種“指紋級(jí)”的定量映射關(guān)系，讓DUVRR不再只是觀察工具，而是能用于生產(chǎn)線、直接通過光譜數(shù)值判定包封率（EE）的精密測量標(biāo)尺。












圖5.以100%mRNA的DUVRR光譜為參考光譜，以mRNA與脂質(zhì)的比例為樣品光譜，在1270–1395 cm?1區(qū)域內(nèi)獲得的2T2D - COS光譜。圖中展示了50%mRNA(A)、60%mRNA(B)、70%mRNA(C)、80%mRNA(D)和90%mRNA(E)的光譜。綠色虛線表示1334 cm?1譜帶。







行業(yè)意義：通往在線質(zhì)控（PAT）與便攜檢測之路







這項(xiàng)技術(shù)的落地，對(duì)mRNA產(chǎn)業(yè)意味著什么？







• 從“破壞性”到“無損”：檢測后的樣品能繼續(xù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或直接使用，對(duì)珍貴樣本和連續(xù)生產(chǎn)工藝監(jiān)控意義重大。

  
  

  
  

• 從“耗時(shí)”到“瞬時(shí)”：單次光譜采集只需數(shù)秒到數(shù)分鐘，為過程分析技術(shù)（PAT）提供了理想工具，有望實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)反饋。

  
  

  
  

• 從“實(shí)驗(yàn)室”到“生產(chǎn)一線”：合作者Alexander Shekhtman教授指出，“完整的LNP不穩(wěn)定，很難用現(xiàn)有技術(shù)表征。拉曼光譜讓我們能在不破壞的情況下分析LNP內(nèi)部的mRNA，這意味著我們可以更快地篩選和優(yōu)化配方?！?/p>

  
  

  
  

Lednev教授接受采訪時(shí)進(jìn)一步展望：“這套系統(tǒng)有望開發(fā)成便攜式設(shè)備。想象一下，未來在疫苗接種點(diǎn)，工作人員能用一臺(tái)小型設(shè)備現(xiàn)場檢測疫苗是否因冷鏈斷裂失效，或者在生產(chǎn)線末端，每一批產(chǎn)品出廠前都經(jīng)過無損、快速的秒級(jí)篩查?！?/p>







結(jié)語







從法醫(yī)鑒定到疫苗質(zhì)控，Igor Lednev團(tuán)隊(duì)的研究展示了一次精彩的“技術(shù)溢出”。一束深紫外激光，連接了犯罪現(xiàn)場與制劑車間，也連接了分子的微觀振動(dòng)與藥品的宏觀質(zhì)量。







當(dāng)然，DUVRR技術(shù)要真正從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)GMP車間，還面臨儀器成本、標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證以及模型泛化能力等挑戰(zhàn)。但它代表的“無損、原位、瞬時(shí)”的質(zhì)控理念，無疑為正在走向成熟的mRNA產(chǎn)業(yè)，點(diǎn)亮了一盞新的航標(biāo)燈。